氯霉素检测试剂盒
使用说明书
（酶联免疫法）
1 原理及用途
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产组织、畜禽组织、肝脏、蛋类、蜂蜜、牛奶及饲料等样本中的氯霉素药物（Chloramphenicol，CAP），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样本溶液，样本中的氯霉素药物和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗氯霉素药物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含氯霉素药物含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氯霉素药物的残留量。
2 技术指标
2.1 试剂盒灵敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反应模式：25℃，30min～30min～15min
2.3 检测下限：
组织、肝脏、蜂蜜、牛奶……………0.025ppb
蛋类……………………………………0.1ppb
尿液、血清、肠衣、饲料、奶粉……0.05ppb
2.4 交叉反应率：
氯霉素 …………………………………100%
甲砜霉素、氟甲砜霉素………………＜0.1%
2.5 样本回收率：
组织、肝脏……………………………85%±20%
蜂蜜、肠衣……………………………85%±25%
牛奶、饲料……………………………75%±25%
尿液、血清……………………………70%±20%
3 试剂盒组成
酶标板……………………………96孔
标准液：各1ml
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
高标准液（红盖）：100ppb………1ml
酶标记物（红盖）…………………11ml
抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml
底物液A（白盖）……………………6ml
底物液B（黑盖）……………………6ml
终止液（黄盖）………………………6ml
20X浓缩洗涤液（白盖）……………40ml
2X复溶液（黄盖）…………………50ml
说明书………………………………1份
4 需要的器材和试剂
4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 试剂：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、醋酸钠、醋酸
、亚硝基铁氰hua钾（K2Fe(CN)5(NO)▪2H2O）、葡萄糖苷酸酶、硫酸锌（ZnSO4·7H2O）
5 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
5.2 配液：
配液1：0.36M亚硝基铁氰hua钾溶液（牛奶、奶粉样本）
11.9g亚硝基铁氰hua钾加去离子水至100ml溶解。
配液2：1.04M硫酸锌溶液（牛奶、奶粉样本）
29.8g硫酸锌加去离子水至100ml溶解。
配液3：0.1M pH4.8醋酸钠缓冲液（尿液样本）
2.4g醋酸钠加去离子水500ml溶解，加1.2ml醋酸混匀。
配液4：乙腈-水溶液
V乙腈:V水=84:16
配液5：复溶液
将2×复溶液用去离子水2倍稀释，用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。
5.3 样本前处理步骤：
5.3.1 组织、鱼、虾、肝脏样本处理方法
1）称取均质后的样本3±0.05g于50ml离心管中，先加入3ml去离子水振荡混匀，再加入6ml乙酸乙酯振荡2分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取上层液体2ml在50-60℃下氮气吹干；
3）用1ml正己烷溶解干燥的残渣，再加入0.5ml复溶液，混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；
4）去除上层有机相，取下层水相50μl进行分析。
样本稀释倍数：0.5 检测下限：0.025ppb
5.3.2 血清、血浆样本处理方法
1）取1ml血清或血浆至离心管中，加入2ml乙酸乙酯振荡1分钟，室温4000转/分离心5分钟，或静置使水相与有机相分离；
2）取全部上层液体在50-60℃下氮气吹干；
3）用1ml正己烷溶解干燥的残渣，再加入1ml复溶液，混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；
4）去除上层有机相，取下层水相50μl进行分析。
样本稀释倍数：1 检测下限：0.05ppb
5.3.3 尿液样本处理方法
1）取2ml尿液至离心管中，加入0.1M pH4.8醋酸钠缓冲液0.5ml混合，加40ul葡萄糖苷酸酶，混匀，37℃水解2小时以上（或过夜）；
2）将上述溶液恢复至室温后加入8ml乙酸乙酯振荡1分钟，室温4000转/分离心10分钟，取4ml上层液体在50-60℃下氮气吹干；
3）用1ml复溶液溶解干燥的残渣，混匀；
4）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：1 检测下限：0.05ppb
5.3.4 蜂蜜样本处理方法
1）取2±0.05g蜂蜜于离心管中，用4ml去离子水溶解，加入4ml乙酸乙酯振荡2分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取上层液体2ml在50-60℃下氮气吹干；
3）用0.5ml复溶液溶解干燥的残渣，混匀；
4）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：0.5 检测下限：0.025ppb
（检测下限0.025ppb，定量下限0.1ppb，因某些样本有干扰建议以0.1ppb作为阳性判定值）
5.3.5 肠衣样本处理方法
1）肠衣经清洗后均质，称取均质后的样本1±0.05g于50ml离心管中，加入10ml乙酸乙酯振荡2分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取上层液体5ml在50-60℃下氮气吹干；
3）用1ml正己烷溶解干燥的残渣，再加入0.5ml复溶液，混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；
4）去除上层有机相，取下层水相50μl进行分析。
样本稀释倍数：1 检测下限：0.05ppb
5.3.6 牛奶样本处理方法
1）将牛奶样本15℃4000转/分离心10分钟，去除上层脂肪，取5ml去脂肪奶样于50ml离心管中，加250ul 亚硝基铁氰hua钾溶液（配液1）振荡混合30秒，加250ul 硫酸锌溶液（配液2）振荡混合30秒，15℃4000转/分离心10分钟；
2）取上层液体2.2ml（相当于2ml鲜奶）于另一离心管中，加入4ml乙酸乙酯振荡2分钟，室温4000转/分离心10分钟；
3）取上层液体2ml在50-60℃下氮气吹干；
4）用0.5ml复溶液溶解干燥的残渣，混匀；
5）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：0.5 检测下限：0.025ppb
（检测下限0.025ppb，定量下限0.05ppb，因某些样本有干扰建议以0.15ppb作为阳性判定值）
5.3.7 奶粉样本处理方法
1）取2±0.05g奶粉于50ml离心管中，用10ml去离子水溶解，加入1ml 亚硝基铁氰hua钾溶液（配液1）和1ml 硫酸锌溶液（配液2）振荡混合，15℃4000转/分离心10分钟；
2）取上层液体3.6ml（相当于0.6g奶粉）于另一离心管中，加入6ml乙酸乙酯振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
3）取上层液体4ml在50-60℃下氮气吹干；
4）用0.4ml复溶液溶解干燥的残渣，混匀；
5）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：1 检测下限：0.05ppb
（检测下限0.05ppb，定量下限0.15ppb，因某些样本有干扰建议以0.15ppb作为阳性判定值）
5.3.8 蛋类样本处理方法
1）取3±0.05g均质的蛋类样本于50ml离心管中，加9ml乙腈-水溶液振荡混合2分钟，15℃4000转/分离心10分钟；
2）取上层液体3ml于另一离心管中，加入3ml去离子水，再加4.5ml乙酸乙酯振荡1分钟，15℃4000转/分离心10分钟；
3）取全部上层液体在50-60℃下氮气吹干；
4）用1ml正己烷溶解干燥的残渣，再加入2ml复溶液，混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；
4）去除上层有机相，取下层水相50μl进行分析。
样本稀释倍数：2 检测下限：0.1ppb
（检测下限0.1ppb，定量下限0.3ppb）
5.3.9 饲料样本处理方法
1）取2±0.05g均质的饲料于50ml离心管中，用2ml去离子水溶解，再加入6ml乙酸乙酯振荡2分钟，15℃4000转/分离心10分钟；
2）取上层液体3ml载50-60℃下氮气吹干；
3）用1ml正己烷溶解干燥的残渣，再加入1ml复溶液，混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；
4）去除上层有机相，取下层水相50μl进行分析。
样本稀释倍数：1 检测下限：0.05ppb
6 酶联免疫试验步骤
将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
实验开始前，用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。
6.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光反应30分钟。
6.3 洗 涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，后用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，25℃避光反应30分钟。
6.5 洗 涤：同上
6.6 显 色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。
6.7 终 止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。
6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。
7 结果分析
7.1 百分吸光率的计算
标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以di一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
A0 |
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
7.2 标准曲线的绘制与计算
以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。
8 注意事项
8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
8.3 混合要均匀，洗板要*，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。
9 贮藏及保存期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
