甲硝唑ELISA检测试剂盒
使用说明书
（酶联免疫法）
1 原理及用途
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测组织、蜂蜜等样本中的甲硝唑（Metronidazole，MNZ），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的甲硝唑和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗甲硝唑抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含甲硝唑含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中甲硝唑的残留量。
2 技术指标
2.1 试剂盒灵敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反应模式：25℃ 30min～30min～15min
2.3 检测下限：
组 织（鸡、鸭肉/肝脏、鱼、虾、等）…………0.25ppb
蜂蜜 ………………………………………………0.25ppb
2.4 交叉反应率：
与类似物的交叉反应率：
甲硝唑(MNZ) ………………………………………100%
二甲硝咪唑DMZ……………………………………68%
2.5 样本回收率：
鱼/虾/禽/肝脏………………………………90±10%
蜂蜜样本 ……………………………………90±10%
3 试剂盒组成
酶标板1块，96孔/板
标准液6瓶（黑盖）：1ml/瓶
0 ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高标准液 100 ppb ………………………………1ml
抗体工作液 (蓝盖)………………………………5.5ml
酶标记物 (红盖)…………………………………11ml
底物液A (白盖)……………………………………6ml
底物液B(黑盖) ……………………………………6ml
终止液(黄盖) ………………………………………6ml
20X浓缩洗涤液(白盖)……………………………40 ml
2X浓缩复溶液(黄盖)…………………………… 50 ml
说明书………………………………………………1份
4 需要的器材和试剂
4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒温箱
4.2 微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl
4.3 试剂：NaOH、无水碳酸钠、碳酸氢钠、正己烷、乙酸乙酯
5 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
5.2 配液：
配液1：0.1M碳酸盐缓冲液
称取4.66g无水碳酸钠，0.5g碳酸氢钠去离子水500ml溶解，pH 10.6 。
配液2：2M 氢氧化钠溶液
称取40g氢氧化钠，加入去离子水500ml溶解。
配液3：洗涤液
将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水稀释。
20X浓缩洗涤液在使用前请按1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水）。可按需配置，稀释后的洗涤液可在4℃保存一个月。
配液4：复溶液
将2X浓缩复溶液用去离子水1:1稀释，用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。
5.3 样本前处理步骤：
5.3.1组 织（鸡、鸭肉/肝脏、鱼、虾、等）、蜂蜜
1）取3g样本，加3ml 0.1M 碳酸盐缓冲溶液振荡至蜂蜜全部溶解；
2）加入9ml 乙酸乙酯，振荡5分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
3）取上层有机相6ml至另一离心管中，加入2ml乙酸乙酯，2ml 2M氢氧化钠溶液，振荡5分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
4）取4ml清澈上层有机相至干净玻璃试管中，30～40℃氮气或空气吹干；
5）加入正己烷1ml，涡动30s，再加入0.5ml复溶液混合30秒，室温4000转/分以上，离心5分钟；
6）去除上层有机相，取下层50µl液体用于分析。
稀释倍数 0.5 检测下限 0.25ppb
6 酶联免疫试验步骤
将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
实验开始前，用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。
6.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光反应30分钟。
6.3 洗 涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，后用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，25℃避光反应30分钟。
6.5 洗 涤：同上
6.6 显 色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。
6.7 终 止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。
6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。
7 结果分析
7.1 百分吸光率的计算
标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以di一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
A0 |
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
7.2 标准曲线的绘制与计算
以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。
8 注意事项
8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
8.3 混合要均匀，洗板要*，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。
9 贮藏及保存期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
