在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。

4. PCR（PCR扩增区）

（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。

（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。

反应体积	25 μL	通道选择	FAM通道采集禽白血病病毒荧光信号
PCR 反应条件	步骤	条件	循环数
	反转录	42℃：10分钟（min）	1
	预变性	95℃：3分钟（min）	1
	预扩增	95℃：5秒（s）	5
	预扩增	55℃：40秒（s）	5
	PCR扩增	95℃：5秒（s）	40
	PCR扩增	55℃：40秒（s）（此阶段结束时采集荧光信号）	40

注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择 None。

【参考值（参考范围）】

1.试剂盒有效性判定：

（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。

（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

2.标本结果判定：

（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。

（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。

【检验结果的解释】

通道及检测结果	标本检测结果解释
FAM	标本检测结果解释
+	标本中检出禽白血病病毒RNA
-	标本中未检出禽白血病病毒 RNA

【检验方法的局限性】

1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的检出限shi可能会发生假阴性的结果。

2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。

3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。

【产品性能指标】
产品的检出限为10² Copies/mL，产品CV值≤5%。

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禽传染性支气管炎病毒检测试剂盒

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