【产品名称】禽liu感病毒H5N6亚型(AIV-H5N6)核酸PCR试剂盒
【包装规格】 50T/盒
【产品方法】双重实时荧光PCR法
【预期用途】
适用于禽liu感病毒H5N6亚型(AIV-H5N6)检测，可用于临床禽liu感病毒H5N6亚型(AIV-H5N6)感染的辅助诊断，但不作确诊使用。
禽liu感病毒H5N6亚型(AIV-H5N6)核酸PCR试剂盒【检验原理】
本试剂盒采用TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对禽liu感病毒H5N6亚型(AIV-H5N6)特异性引物，结合一条特异性探针，利用相应仪器对PCR 过程进行实时监测，实现检测结果的定性分析，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【主要组成成份】
反应液、酶液、阳性质控品、阴性质控品。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【保存和运输】上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。
【使用方法】
1 样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
血液、体液和棉拭子样本取100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
1.2 核酸提取
推荐采用核酸提qu或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。
2.试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管 数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：
试剂 | RP反应液 | 酶液 |
用量（样本数为N） | 20μL | 1μL |
将混合好的测试反应液分装到PCR 反应管中，21μL/管。
3.加样（样本处理区）
将步骤1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短 暂离心。
4.PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR 仪反应槽内；
4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL； 荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3推荐循环参数设置：
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1cycle | 42℃ | 20min | 否 |
2 | 1cycle | 95℃ | 10min | 否 |
3 | 40cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5.结果分析判定
5.1结果分析条件设定
设置Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像 调节 Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范围内调节）、stop 值（一般可在 5~20 范围内调节），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖动阈值线至高于阴性对照），重新分析结果。
5.2结果判断
阳性：检测通道Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线； 可疑：检测通道 35值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35值≤38，且曲线有明显的增长曲线， 判定为阳性，否则为阴性； 阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
6.质控标准
阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7.检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果； 7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.所有操作严格按照说明书进行；
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完quan混匀并短暂离心；
3.反应液应避光保存；
4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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